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【INC国际前沿研究】激酶组药物筛选揭示多靶点酪氨酸激酶抑制剂协同作用及ATRT靶向治疗策略

James T. Rutka鲁特卡教授曾任世界神经外科学院院长,现任世界神经外科知名期刊《Journal of Neurosurgery》主编。其发表的研究《A kinome drug screen identifies multi-TKI synergies and ERBB2 signaling as a therapeutic vuln
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  James T. Rutka鲁特卡教授曾任世界神经外科学院院长,现任世界神经外科知名期刊《Journal of Neurosurgery》主编。30余年来深耕儿童神经外科研究,带领团队在脑瘤分子分型、精准治疗、新药研发及微创治疗领域持续突破,为全球神经外科疑难病患儿带来希望。其发表的研究《A kinome drug screen identifies multi-TKI synergies and ERBB2 signaling as a therapeutic vulnerability in MYC/TYR subgroup atypical teratoid rhabdoid tumors》(激酶组药物筛选揭示多靶点酪氨酸激酶抑制剂协同作用及ERBB2信号靶向治疗MYC/TYR亚组非典型畸胎样/横纹肌样瘤的新策略),以下是研究概述。

01PART研究背景

  非典型畸胎样/横纹肌样瘤(ATRT)是一种罕见且预后极差的儿童恶性脑肿瘤。最新研究已将其分为3个分子亚组(SHH、TYR、MYC),各亚组疾病模式与信号特征存在显著差异,但针对各亚组的有效治疗策略尚未明确。

02PART研究亮点

  首次阐明MYC/TYR亚组ATRT的有效联合治疗方案。

  在前临床模型中证实阿法替尼(Afatinib)靶向ERBB2可显著延长生存期。

03PART研究意义

  通过评估包含临床级激酶抑制剂的定制库,本研究明确了ATRT各分子亚组的信号依赖性。发现了MYC/TYR亚组ATRT的联合治疗靶点,揭示其依赖ERBB2表达及新型表观遗传调控机制。最终,在前临床小鼠模型中证实阿法替尼靶向ERBB2可延长生存期。综上,本研究揭示了ATRT亚组的关键可靶向信号依赖,为临床应用提供了直接的抑制剂选择依据。

04PART研究方法

  利用465种激酶抑制剂对按分子亚组分型(SHH、TYR、MYC)的ATRT细胞系进行功能性筛选,并结合多组学分析(转录组、表观基因组)探讨抑制剂效应的分子机制。

05PART研究结果

  ATRT细胞系普遍对靶向PI3K/MAPK通路抑制剂、CDK抑制剂、AURKA/B抑制剂及PLK1抑制剂敏感。研究鉴定出两类主要靶向受体酪氨酸激酶(PDGFR与EGFR/ERBB2)的多靶点酪氨酸激酶抑制剂(Multi-TKI),在MYC/TYR亚组中活性显著。PDGFRB抑制剂达沙替尼(Dasatinib)与广谱PI3K/MAPK通路抑制剂(雷帕霉素/Rapamycin、曲美替尼/Trametinib)联用时,对MYC/TYR亚组ATRT细胞生长产生协同抑制作用。MYC/TYR亚组ATRT细胞对多种ERBB2信号抑制剂高度敏感。转录组、H3K27Ac ChIP-seq、ATAC-seq及HiChIP分析显示,原发MYC/TYR亚组ATRT中ERBB2表达与差异甲基化及DNA环介导的特异性增强子激活相关。值得注意的是,具有脑渗透性的EGFR/ERBB2抑制剂阿法替尼(Afatinib),在体外和体内均显著抑制MYC/TYR亚组ATRT细胞生长并延长荷瘤动物生存期。

图 1 各亚组特异及广谱激酶抑制剂反应 (A) 药物筛选工作流程示意图 (B) 细胞系与肿瘤组之间全转录组组间相关性的热图。正 z 分数相关系数表示相似度更高。 (C) 对 6 株 ATRT 细胞系(CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05、BT-12、CHLA-06 和 BT-16)实验测得的药物 EC50 值进行无监督皮尔森相关层次聚类的热图。 (D) 火山图展示 SHH ATRT 细胞系(CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05)与 MYC/TYR 细胞系(CHLA-06、BT-12、BT-16)之间 EC50 差异的 Welch T 检验;垂直虚线表示 1 μM 差异阈值,水平虚线表示 P<0.05 阈值。 (E) 在各亚组细胞系间 EC50 均值差异显著的激酶抑制剂列表。 (F) 跨全部 6 株细胞系平均 EC50 值由低到高排序的 30 种广谱激酶抑制剂列表,按共同靶点类别排列。

图1 各亚组特异及广谱激酶抑制剂反应:(A) 药物筛选工作流程示意图。(B) 细胞系与肿瘤组织间全转录组相关性的热图。正z分数相关系数表示更高相似度。(C) 对6株ATRT细胞系(CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05、BT-12、CHLA-06、BT-16)测定的药物EC50值进行无监督皮尔森相关层次聚类的热图。(D) 火山图展示SHH亚组细胞系(CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05)与MYC/TYR亚组细胞系(CHLA-06、BT-12、BT-16)间EC50差异的Welch T检验;垂直虚线为1 μM差异阈值,水平虚线为P<0.05阈值。(E) 在各亚组细胞系间EC50均值差异显著的激酶抑制剂列表。(F) 按平均EC50值(低至高)排序的30种广谱激酶抑制剂列表,按共同靶点类别分组。

图 2. 达沙替尼诱导细胞周期阻滞,并与 MTOR 及 MAPK 信号通路抑制剂产生协同作用。 (A) BT-16 细胞系经 200 nM 达沙替尼(D)处理 24 h 及 72 h 后的细胞周期分析,与 DMSO 溶剂对照(V)比较。 (B) 经 200 nM 达沙替尼(D)处理 24 h 及 72 h 后的 Caspase 3/7 活性,相对于 0.1% DMSO(V)测定。 (C) qRT-PCR 检测 200 nM 达沙替尼(D)处理 24 h 后 P53、CDKN1A 和 CDKN2A mRNA 的相对表达变化(P<0.001),以 DMSO(V)为对照。 (D) Western blot 检测 BT-16 细胞经 100 nM 达沙替尼处理 24 h 及 72 h 后 P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204) 和 ERK1/2 的表达,与 DMSO(V)对照比较。 (E) 达沙替尼与雷帕霉素的剂量矩阵联合作用的 BRAID 协同分析。 (F) 达沙替尼与曲美替尼的剂量矩阵联合作用的 BRAID 协同分析。

图2 达沙替尼诱导细胞周期阻滞并与MTOR/MAPK通路抑制剂协同:(A) BT-16细胞经200 nM达沙替尼(D)处理24h及72h后的细胞周期分析(对比DMSO对照/V)。(B) 200 nM达沙替尼(D)处理24h及72h后的Caspase 3/7活性(对比0.1% DMSO/V)。(C) qRT-PCR检测200 nM达沙替尼(D)处理24h后P53、CDKN1A、CDKN2A mRNA相对表达变化(P<0.001,对比DMSO/V)。(D) Western blot检测BT-16细胞经100 nM达沙替尼处理24h及72h后P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2表达(对比DMSO/V)。(E) 达沙替尼与雷帕霉素剂量矩阵联合作用的BRAID协同分析。(F) 达沙替尼与曲美替尼剂量矩阵联合作用的BRAID协同分析。
图 3 ERBB2 在 MYC/TYR 型 ATRT 中表达上调,仅在该亚型细胞系表达,且为细胞存活所必需。 (A) 以人胎脑额叶(FB-FL)为参照,qRT-PCR 检测 ATRT 细胞系 ErbB 家族成员的表达水平。 (B) HT12 基因表达芯片检测 60 例原发 ATRT 中 ERBB2 的亚组特异性表达。 (C) Western blot 检测 ATRT 细胞系 ERBB2 与 EGFR 表达;*SHH 型 ATRT 细胞系(CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05)中 ERBB2 蛋白不可检出。 (D) ATRT 细胞系经 siRNA 敲低 ERBB2 96 h 后,Western blot 检测 ERBB2、P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2 及微管蛋白。 (E–H) ERBB2 siRNA 与 Scramble 对照(Scr)处理 MYC/TYR 型细胞系后增殖曲线(Alamar Blue 法):(E)BT-16,(F)CHLA-06,(G)BT-12,(H)CHLA-266。 (I–J) 19 例 ATRT 亚组(RNA-Seq)中 ERBB2 长转录本(NM_001005862)(I)与短转录本(NM_004448)(J)的表达。

图3 ERBB2在MYC/TYR型ATRT中上调表达、亚型特异性存在且为细胞存活必需:(A) qRT-PCR检测ATRT细胞系ErbB家族成员表达(人胎脑额叶/FB-FL为参照)。(B) HT12基因表达芯片检测60例原发ATRT中ERBB2的亚组特异性表达。(C) Western blot检测ATRT细胞系ERBB2与EGFR表达;*SHH亚组细胞系(CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05)未检出ERBB2蛋白。(D) siRNA敲低ERBB2 96h后,Western blot检测ATRT细胞系ERBB2、P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2及微管蛋白表达。(E-H) ERBB2 siRNA与Scramble对照(Scr)处理MYC/TYR细胞系后的增殖曲线(Alamar Blue法):(E)BT-16, (F)CHLA-06, (G)BT-12, (H)CHLA-266。(I-J) 19例ATRT亚组(RNA-Seq)中ERBB2长转录本(NM_001005862)(I)与短转录本(NM_004448)(J)的表达。
图 4 ERBB2 短转录本相关增强子元件在 MYC/TYR ATRT 中呈现差异性甲基化与染色质构象 (A) 以 RefSeq 基因注释(chr17:37 760 000–37 940 000)为参照,示意 SHH、TYR 与 MYC 原发 ATRT 中 ERBB2(粉色)位点的 ATAC-seq 与 H3K27Ac ChIP-seq 结果,并标注预测的 ERBB2 及 FANTOM5 图谱增强子轨迹。放大视图 EnhE(增强子元件)与 ERBB2 短转录本相关,并显示与重叠基因 GRB7(蓝色)基因体的相对位置。TYR 与 MYC ATRT 中 EnhE 的开放可及区域与 H3K27Ac 峰图、甲基化探针及选定转录因子结合域(chr17:37 892 000–37 900 000)一并展示。EnhE 内相对低甲基化探针在 MYC/TYR ATRT 中以红色标注(P<0.05)。 (B) IGV 轨迹展示基于 H3K27Ac HiChIP 的 ERBB2 位点环化关系。每条弧代表一个环,y 轴表示支持该相互作用的读对数目。显著接触(FDR<0.05)以彩色显示,淡色表示不显著环。ChIP-seq 匹配的 H3K27Ac 富集峰同时展示,轨迹峰高对应给定基因组区域的读数。ERBB2 启动子远端区域以高 H3K27Ac 水平标记。

图4 MYC/TYR ATRT中ERBB2短转录本相关增强子元件呈现差异甲基化与染色质构象:(A) RefSeq基因注释(chr17:37 760 000--37 940 000)参照下,展示SHH、TYR、MYC原发ATRT中ERBB2(粉色)位点的ATAC-seq与H3K27Ac ChIP-seq结果,标注预测的ERBB2及FANTOM5增强子轨迹。放大视图显示与ERBB2短转录本相关的增强子元件EnhE及其与重叠基因GRB7(蓝色)的相对位置。TYR/MYC ATRT中EnhE的开放区域、H3K27Ac峰、甲基化探针及转录因子结合域(chr17:37 892 000--37 900 000)一并展示。EnhE内相对低甲基化探针在MYC/TYR ATRT中以红色标注(P<0.05)。(B) IGV轨迹展示基于H3K27Ac HiChIP的ERBB2位点环化关系。弧线代表环,y轴为支持相互作用的读对数。显著接触(FDR<0.05)以彩色显示,淡色为非显著环。匹配的H3K27Ac ChIP-seq富集峰同步展示,峰高对应读数。ERBB2启动子远端区域以高H3K27Ac水平标记。
图 5 MYC/TYR 细胞系对 EGFR/ERBB2 抑制剂具有显著敏感性 (A–F) ATRT 细胞系接受临床可应用的 EGFR/ERBB2 抑制剂处理的剂量-反应曲线:(A) 达克替尼;(B) AEE-788;(C) 吉非替尼;(D) 阿法替尼;(E) 拉帕替尼;(F) 厄洛替尼。 (G) 以 AlamarBlue 荧光法检测 BT-16 和 CHLA-06 细胞系在递增浓度阿法替尼处理 3 天后的活力。 (H) BT-16 和 CHLA-06 细胞经 100 nM 阿法替尼处理 24 h 后的 Caspase 3/7 活性,以 0.1% DMSO 为对照。 (I) BT-16 和 CHLA-06 细胞系经 100 nM 阿法替尼处理 24 h 后的细胞周期分析,与 DMSO 对照比较。 (J) CHLA-16 和 CHLA-06 细胞系接受梯度浓度阿法替尼(0.0001–1 µM)处理后,Western blot 检测 P-ERBB2(Tyr 1221/1222)、ERBB2、P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr 202/Tyr204)、ERK1/2 及微管蛋白的表达。

图5 MYC/TYR细胞系对EGFR/ERBB2抑制剂高度敏感:(A-F) ATRT细胞系接受临床可用EGFR/ERBB2抑制剂的剂量-反应曲线:(A)达克替尼/Dacomitinib, (B)AEE-788, (C)吉非替尼/Gefitinib, (D)阿法替尼/Afatinib, (E)拉帕替尼/Lapatinib, (F)厄洛替尼/Erlotinib。(G) AlamarBlue荧光法检测BT-16、CHLA-06细胞在递增浓度阿法替尼处理3天后的活力。(H) BT-16、CHLA-06细胞经100 nM阿法替尼处理24h后的Caspase 3/7活性(对比0.1% DMSO)。(I) BT-16、CHLA-06细胞经100 nM阿法替尼处理24h后的细胞周期分析(对比DMSO)。(J) CHLA-16(注:原文此处似为BT-16之误)、CHLA-06细胞经梯度浓度阿法替尼(0.0001--1 µM)处理后,Western blot检测P-ERBB2(Tyr 1221/1222)、ERBB2、P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2及微管蛋白表达。
图 6 ERBB2/EGFR 抑制剂阿法替尼在 ATRT 原位小鼠模型中延长存活。 (A) 对携带 BT-16 细胞系异种移植物的 NSG 小鼠每日 25 mg/kg 阿法替尼灌胃 14 天的 Kaplan–Meier 生存曲线:对照组中位存活 47 天,阿法替尼组 56 天,P < 0.001。 (B) BT-16 异种移植物 NSG 小鼠(冠状面)对照组与阿法替尼(25 mg/kg)组的 H&E 染色。 (C) 免疫组化染色检测 AKT Thr 308 磷酸化(P-AKT-Thr308),下方为光密度定量:对照组 (n = 9) 与阿法替尼组 (25 mg/kg, n = 9)。 (D) Ki-67 免疫组化染色,下方为阳性细胞/总细胞比值:对照组 (n = 9) 与阿法替尼组 (25 mg/kg, n = 9)。 (E) 裂解型 Caspase 3 免疫组化染色,下方为阳性细胞/总细胞比值:对照组 (n = 9) 与阿法替尼组 (25 mg/kg, n = 9)。

图6 ERBB2/EGFR抑制剂阿法替尼延长ATRT原位小鼠模型生存期:(A) 携带BT-16异种移植物的NSG小鼠接受每日25 mg/kg阿法替尼灌胃14天的Kaplan-Meier生存曲线:对照组中位生存47天,阿法替尼组56天(P<0.001)。(B) BT-16异种移植物NSG小鼠(冠状面)对照组与阿法替尼组(25 mg/kg)的H&E染色。(C) 免疫组化检测AKT Thr308磷酸化(P-AKT-Thr308),下方为光密度定量:对照组 (n=9) vs 阿法替尼组 (25 mg/kg, n=9)。(D) Ki-67免疫组化染色,下方为阳性细胞/总细胞比值:对照组 (n=9) vs 阿法替尼组 (25 mg/kg, n=9)。(E) 裂解型Caspase 3免疫组化染色,下方为阳性细胞/总细胞比值:对照组 (n=9) vs 阿法替尼组 (25 mg/kg, n=9)。

06PART研究结论

  本研究提出联合靶向PDGFR与ERBB2的酪氨酸激酶抑制剂及PI3K/MAPK通路抑制剂,作为MYC/TYR亚组ATRT的新治疗策略。

07PART关于作者

国际儿童神经外科专家 James T. Rutka鲁特卡教授

图 6 ERBB2/EGFR 抑制剂阿法替尼在 ATRT 原位小鼠模型中延长存活。 (A) 对携带 BT-16 细胞系异种移植物的 NSG 小鼠每日 25 mg/kg 阿法替尼灌胃 14 天的 Kaplan–Meier 生存曲线:对照组中位存活 47 天,阿法替尼组 56 天,P < 0.001。 (B) BT-16 异种移植物 NSG 小鼠(冠状面)对照组与阿法替尼(25 mg/kg)组的 H&E 染色。 (C) 免疫组化染色检测 AKT Thr 308 磷酸化(P-AKT-Thr308),下方为光密度定量:对照组 (n = 9) 与阿法替尼组 (25 mg/kg, n = 9)。 (D) Ki-67 免疫组化染色,下方为阳性细胞/总细胞比值:对照组 (n = 9) 与阿法替尼组 (25 mg/kg, n = 9)。 (E) 裂解型 Caspase 3 免疫组化染色,下方为阳性细胞/总细胞比值:对照组 (n = 9) 与阿法替尼组 (25 mg/kg, n = 9)。

  James T. Rutka鲁特卡教授是世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会及顾问委员会成员,发表学术论文超过500篇。临床研究方向聚焦颅内肿瘤,在胶质瘤、纤维瘤、颅咽管瘤室管膜瘤诊疗方面拥有丰富经验。擅长清醒开颅术、显微手术以及国际前沿技术激光间质热疗(LITT),后者广泛应用于恶性脑瘤及癫痫治疗。针对儿童胶质瘤,尤其是高级别胶质瘤开展了多项临床试验。其所在的加拿大多伦多病童医院(SickKids)是国际知名儿童医院之一。

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  • 更新时间:2025-08-17 11:02:43

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